A microplate adaptation of the thiobarbituric acid reactive substances assay to determine lipid peroxidation fluorometrically in small sample volumes / Una adaptación de microplacas del ensayo de sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico para determinar la peroxidación lipídica fluorométricamente en pequeños volúmenes de muestra

A simple, fast, reproducible and low-cost assay for thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) has been adapted for use with a microplate spectrofluorometer. The technique allows rapid analysis of multiple samples and requires a very small sample volume (50 μl of red cell homogenates from passerine birds at protein concentrations of 3.4-8.9 mg/ml in this study), what is of special interest for biomonitoring studies working with small-sized animals from which a limited amount of sample can be obtained. The TBARS test involves the reaction of thiobarbituric acid (TBA) with malondialdehyde (MDA) under heating (90°C), leading to the formation of products that can be measured fluorometrically using black 384-well plates at excitation/emission wavelength of 532/553 nm. The concentrations of peroxidized lipids in samples were determined by extrapolation from a MDA standard curve. Two different excitation/emission combinations (532/553 and 530/550 nm) were used and both pairs were suitable for this technique. Intra- and inter-plate variability was < 20% and a good linearity of the standard curve was observed (R2 > 0.99). The research use of this microplate adaptation of the TBARS assay will provide further data and understanding of lipid peroxidation reducing the limitation of small sample volumen (AU)

El presente trabajo adapta un ensayo sencillo, rápido, reproducible y económico de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) para su uso en espectrofluorómetro para microplacas. La técnica permite un análisis rápido de múltiples muestras y requiere un mínimo volumen de muestra (50 μl de un homogeneizado de eritrocitos de aves paseriformes a una concentración proteica de 3.4-8.9 mg/ml en este estudio), lo cual resulta de especial interés en estudios de biomonitorización que trabajan con animales de pequeño tamaño de los que se puede obtener una cantidad de muestra limitada. El ensayo TBARS consiste en la reacción del ácido tiobarbitúrico (TBA) con malondialdehído (MDA) en condiciones de calor (90°C), formando productos que pueden medirse fluorométricamente usando microplacas negras de 384 pocillos a 532/553 nm de excitación/emisión. La concentración de peróxidos lipídicos en la muestra se determinó por extrapolación de una curva de MDA. Se utilizaron dos combinaciones diferentes de excitación/emisión (532/553 and 530/550 nm) y ambas fueron apropiadas para la técnica. La variabilidad intra- e inter-placa fue <20% y se observó una buena linealidad de la curva estándar (R2 >0.99). El uso científico de la adaptación a microplaca del ensayo TBARS proporcionará más datos y comprensión sobre la peroxidación lipídica reduciendo la limitación que supone los pequeños volúmenes de muestra (AU)

Adecuación e idoneidad de los contenidos de la asignatura de Toxicología para el perfil profesional del egresado veterinario / No disponible

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